Cromatógrafo Líquido

. O Cromatógrafo a Líquido

                               O cromatógrafo a líquido (mais comumente conhecido pela sigla inglesa da técnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em português: Cromatografia Líquida de Alto Desempenho), é um instrumento mais simples que o cromatógrafo a gás nos seguintes aspectos:

a) só possui um canal analítico, enquanto CG’s podem ter até quatro canais;

b) é modulado, isto é, sistema de bombeamento e detetor são independentes, o que facilita a substituição de detetores;

c) opera geralmente à temperatura ambiente;

                               A Figura 4.3 é um diagrama em blocos de um CL típico. Cada bloco é descrito a seguir:

Figura 4.3 - Diagrama em blocos de um HPLC típico

                               a) Reservatório de Fase Móvel

                               A Fase Móvel (um líquido puro ou uma mistura de composição definida) deve ser filtrada em membranas com 0,46 mm de diâmetro de poros e desgaseificada (ver próximo item).

                               b) Sistema de desgaseificação

                               A Fase Móvel deve ser desgaseificada, para evitar a formação de bolhas, as quais podem provocar cavitação (com conseqüente dano à bomba) ou gerar picos falsos, ao passarem pela célula do detetor. São conhecidas várias técnicas de desgaseificação:

                               - aquecimento com agitação;

                               - borbulhamento de gás hélio;

                               - ultra-som;

                               - vácuo

                               c) Bomba

                               O bombeamento da Fase Móvel é realizado por uma bomba controlada por um microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de sucção (para evitar vaporização de fase móvel mais volátil) e a vazão (importante quando a análise é realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo caso há necessidade de uma segunda bomba; ver mais adiante).

                               d) Válvula de injeção

                               A amostra é sempre introduzida com auxílio de uma válvula, porquanto a pressão de trabalho nunca é menor que 50 atmosferas .

                               e) Coluna

                               As colunas empregadas em CL são retas, uma vez que seu comprimento raramente ultrapassa 30 cm, ocupando portanto muito pouco espaço no equipamento.

                               f) Detetor

                               Os detetores utilizados em CL serão descritos na próxima seção.

                               g) Sistema de aquisição de dados.

                               Os sistemas de aquisição de dados empregados em CL são exatamente os mesmos empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores .

Gradiente de Polaridade

                               Quando o CL dispõe de apenas uma bomba, é evidente que a fase móvel tem uma composição constante, do início ao fim da análise. Nessa situação, a polaridade da mesma também é constante. Diz-se então que o processo é isocrático. Quando dispõe-se de duas bombas (ou mais), é possível variar a composição da fase móvel, colocando-se em cada reservatório um líquido de polaridade diferente. O microprocessador altera a vazão de cada linha de líquido, de modo que a partir do ponto de confluência a vazão seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre com gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade.

                               4.3. Detetores

4.3.1. Generalidades

                               Os detetores mais empregados são do tipo diferencial. A sua resposta (R), dada pelas áreas relativas dos picos, é proporcional à concentração de cada componente (detetores de condutividade térmica) ou à velocidade de fluxo de massa do componente (detetores de ionização):

                                              

                               Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os seguintes: detetor de condutividade térmica (DCT), detetor de ionização de chama (DIC) e detetor de índice de refração (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicação.

                               A escolha do detetor é importante e depende do material a ser analisado. As principais características dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleção do detetor mais apropriado, são as seguintes:

- Sensibilidade - Nível de ruído - Resposta

- Faixa de linearidade dinâmica - Custo/vida útil - Universalidade

- Especificidade / Seletividade - Condutividade térmica (para DCT)

                                               4.3.2. Detetores  empregados em Cromatografia a Gás

                               a) Detetor de Condutividade Térmica (DCT)

                               O sistema de detecção por diferença de condutividade térmica consiste de dois filamentos (célula para amostra e célula de referência), os quais fazem parte de uma ponte de Wheatstone (Figuras 4.4a e 4.4b). Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes perdem calor para o gás de arraste. No momento em que a amostra atingir a célula correspondente, o filamento perderá calor para a solução (gás de arraste + amostra). Como a solução possui condutividade diferente, a temperatura do filamento é alterada, o mesmo ocorrendo com a sua resistência elétrica. Essa variação na resistência é medida pela ponte. Note-se que quanto maior for a concentração do material analisado, maior será a variação na corrente e portanto maior será o sinal (R = K.C).              

               

               

IMPORTANTE ! Se a câmara do detetor contiver ar atmosférico no momento em que o circuito for energizado ocorrerá queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer circular o gás de arraste.

Figura 4.4.a - Bloco do Detetor de Condutividade Térmica.

b) Detetor de Ionização de Chama (DIC)

                               A figura 4.5 representa o circuito eletrônico de um DIC. R_v é uma resistência variável, cujo valor depende do número de partículas entre os eletrodos. O efluente da coluna, ao passar entre os eletrodos, é ionizado. Nos DIC, a fonte de ionização é a chama resultante da combustão de hidrogênio com ar (gases auxiliares). A corrente contínua gerada pela fonte (fonte CC, Fig 4.5.b) é transportada do polarizador para o coletor (Fig 4.5.a) por impurezas existentes na fase móvel ou por partículas de fase estacionária líquida arrastada pela fase móvel, por exemplo. No amplificador existe outra fonte de corrente, sendo esta variável e de sentido contrário, permitindo assim zerar a corrente resultante no circuito. Quando um componente da amostra atinge o detetor, caso possua átomos de carbono e átomos de hidrogênio, entrará em combustão, sendo ionizado. Com a ionização, aumenta a corrente saída do coletor, o que irá gerar uma tensão (DV), a qual é ampliada pelo amplificador eletrométrico e enviada ao registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade do detetor dependerá da facilidade relativa de ionização de cada componente da amostra.

Figura 4.4b- Diagrama Eletrônico do DCT

Fig. 4.5.a- Estrutura física de um DIC

                               c) Detetor de Captura Eletrônica (DCE)

                               Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao contrário daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos eletrodos (R_v). Uma fonte de ³H^-1 ou de ⁶³Ni ioniza as moléculas do gás de arraste (N₂), liberando os elétrons responsáveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substância capaz de absorver esses elétrons passar pelo detetor, haverá uma queda na corrente, resultando num sinal que também será amplificado e enviado ao registrador.

                               Aqui, a sensibilidade do detetor depende da capacidade de absorção de elétrons por parte dos diversos componentes da amostra.

Fig. 4.5.b- Circuito eletrônico de um DIC / DCE

                               d) Propriedades dos detetores

                               A Tabela 4.1 é auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos detetores, auxiliando no trabalho de seleção do detetor mais apropriado para uma análise. O Apêndice 5 descreve outros detetores de uso menos extensivo, como o DNP.

Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detetores empregados em CFG.

PROPRIEDADES	DCT	DIC	DNP	DCE
Limite de detecção	1 ppm	100 ppb	0,1 ppb	0,1 ppb
Faixa de linearidade	104	107	104	102
Vazão da fase móvel	1-103 mL/min	1-200 mL/min	10-100 mL/min	10-100 mL/min
Quant. Típica amostra	1 - 40 mL	0,05 - 5 mL	1 - 5 mL	1 - 5 mL
Comp.   Detectados	todos	orgânicos	nitrogenados e fosforados	halogenados
Áreas de aplicação	uso geral	orgânicos	resíduos de pesticidas	resíduos de pesticidas

                                               4.3.3. Detetores empregados em CLAD

                               Os detetores mais empregados em Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detetores são:

                               a) Detetores de índice de refração

                               À semelhança do detetor  de condutividade térmica, o detetor de índice de refração é o mais antigo, menos sensível e o único universal, dentre os detetores empregados em CLAD. Baseando-se na diferença de índice de refração entre a fase móvel e cada componente da amostra, conhecem-se dois tipos de detetores IR:

·       Os detetores tipo deflexão utilizam como elemento ativo um diodo capaz de gerar uma corrente contínua cuja intensidade é proporcional ao ângulo de incidência da luz que atravessa a célula (Figura 4.6). Ao passar pela célula analítica uma substância com índice de refração diferente daquele da fase móvel, haverá uma alteração no ângulo de incidência, resultando numa variação na intensidade de corrente, que é proporcional à concentração dessa substância na célula e consequentemente também proporcional à sua concentração na amostra.

Figura 4.6 - Detetor de Índice de Refração tipo deflexão.

·       Os detetores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema mostrado na Fig. 4.7 ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz é refletida e a outra parte é refratada. De acordo com a Lei de Fresnel, a relação entre essas duas frações é função do índice de refração. Assim, ao passar uma substância (transportada pela fase móvel) pela célula, altera-se o índice de refração e portanto o percentual de luz refratada. Utilizando-se como foto-detetor um diodo sensível à intensidade de luz, a corrente gerada por este será alterada de um modo proporcional à concentração dessa substância na amostra.   

                               b) Detetores de UV-VIS

                               Os detetores de ultravioleta-visível (UV-VIS) baseiam-se na Lei de Lambert-Beer, que estabelece uma relação linear entre Absorbância e Concentração:

A = e . l . c

onde l é o caminho ótico (distância percorrida pela luz dentro da solução; espessura da célula). A constante de proporcionalidade e denomina-se absortividade molar. A absorbância, por sua vez, é proporcional à transmitância, fração de luz transmitida.

                               Quando o conteúdo da célula (Fig. 4.8) é transparente à radiação empregada (UV ou VIS), a transmitância é 100 % e evidentemente a absorbância é ZERO.

                               Entretanto, quando chega à célula uma substância que absorva essa luz, o sistema de detecção mede a diferença em intensidade, gerando o cromatograma correspondente.

                               Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de radiação uma lâmpada de mercúrio, cujo comprimento de onda principal (90 % do total da radiação) mede 254 nm. Esses instrumentos, portanto,  operam com um comprimento de onda fixo (e único). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemático desse tipo de instrumento. Como a região útil da radiação UV varia de 190 a 300 nm, é de se esperar que mesmos os compostos que absorvem luz UV não venham a ser detectados em um detetor do tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma varredura em toda a região UV, é primordial, evidentemente, que a fonte de radiação (lâmpada de deutério) possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de interesse (fonte não monocromática). Desse modo, o instrumento (UV variável) necessita de um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a amostra com uma luz monocromática. Esse dispositivo chama-se “monocromador”. Para se operar na faixa visível (400-750 nm), emprega-se uma lâmpada de tungstênio.

Figura 4.7 - Detetor de Índice de Refração tipo Fresnel.

Figura 4.8 - Detetor de Ultravioleta fixo

Fonte: SCHULER Alexandre. Cromatografia. Pernambuco: UFPE, 2009.